大鼠E-選擇素（E-selectin）試劑盒操作說明

試驗(yàn)原理：
大鼠E-選擇素E-selectin試劑盒是固相夾心法酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)（ELISA）.已知E-selectin 濃度的標(biāo)準(zhǔn)品、未知濃度的樣品加入微孔酶標(biāo)板內(nèi)進(jìn)行檢測。先將E-selectin 和標(biāo)記的抗體同時溫育。洗滌后，加入親和素標(biāo)記過的HRP。再經(jīng)過溫育和洗滌，去除未結(jié)合的酶結(jié)合物，然后加入底物A、B，和酶結(jié)合物同時作用。產(chǎn)生顏色。顏色的深淺和樣品中E-selectin 的濃度呈比例關(guān)系。

操作注意事項(xiàng)

．試劑應(yīng)按標(biāo)簽說明書儲存，使用前恢復(fù)到室溫。稀稀過后的標(biāo)準(zhǔn)品應(yīng)丟棄，不可保存。

2．實(shí)驗(yàn)中不用的板條應(yīng)立即放回包裝袋中，密封保存，以免變質(zhì)。

3．不用的其它試劑應(yīng)包裝好或蓋好。不同批號的試劑不要混用。保質(zhì)前使用。

4．使用一次性的吸頭以免交叉污染，吸取終止液和底物A、B液時，避免使用帶金屬部分的加樣器。

5．使用干凈的塑料容器配置洗滌液。使用前充分混勻試劑盒里的各種成份及樣品。

6．洗滌酶標(biāo)板時應(yīng)充分拍干，不要將吸水紙直接放入酶標(biāo)反應(yīng)孔中吸水。

7．底物A應(yīng)揮發(fā)，避免長時間打開蓋子。底物B對光敏感，避免長時間暴露于光下。避免用手接觸，有毒。實(shí)驗(yàn)完成后應(yīng)立即讀取OD值。

8．加入試劑的順序應(yīng)一致，以保證所有反應(yīng)板孔溫育的時間一樣。

9．按照說明書中標(biāo)明的時間、加液的量及順序進(jìn)行溫育操作。

樣品收集、處理及保存方法

、血清-----操作過程中避免任何細(xì)胞刺激。使用不含熱原和內(nèi)毒素的試管。收集血液后，000×g離心0分鐘將血清和紅細(xì)胞迅速小心地分離。

2、血漿-----EDTA、檸檬酸鹽、肝素血漿可用于檢測。000×g離心30分鐘去除顆粒。

3、細(xì)胞上清液---000×g離心0分鐘去除顆粒和聚合物。

4、保存------大鼠E-選擇素E-selectin如果樣品不立即使用，應(yīng)將其分成小部分-70 ℃保存，避免反復(fù)冷凍。盡可能的不要使用溶血或高血脂血。如果血清中大量顆粒，檢測前先離心或過濾。不要在37℃或更高的溫度加熱解凍。應(yīng)在室溫下解凍并確保樣品均勻地充分解凍。

試劑的準(zhǔn)備

．標(biāo)準(zhǔn)品：標(biāo)準(zhǔn)品的系列稀釋應(yīng)在實(shí)驗(yàn)時準(zhǔn)備，不能儲存。稀釋前將標(biāo)準(zhǔn)品振蕩混勻。稀釋比例按下表中進(jìn)行：

400 ng/ml（6號標(biāo)準(zhǔn)品）原倍濃度不用稀釋直接加入50ul。

200 ng/ml（5號標(biāo)準(zhǔn)品）00ul的原倍標(biāo)準(zhǔn)品加入00ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

00 ng/ml（4號標(biāo)準(zhǔn)品）00ul的5號標(biāo)準(zhǔn)品加入00ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

50 ng/ml（3號標(biāo)準(zhǔn)品）00ul的4號標(biāo)準(zhǔn)品加入00ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

25 ng/ml（2號標(biāo)準(zhǔn)品）00ul的3號標(biāo)準(zhǔn)品加入00ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

2.5 ng/ml（號標(biāo)準(zhǔn)品）00ul的2號標(biāo)準(zhǔn)品加入00ul的標(biāo)準(zhǔn)品稀釋液

0 ng/ml（空白對照）原始濃度不用稀釋直接加入50ul。

2．洗滌緩沖液（20×）的稀釋：蒸餾水20倍稀釋。

操作步驟

．使用前，將所有試劑充分混勻。不要使液體產(chǎn)生大量的泡沫，以免加樣時加入大量的氣泡，產(chǎn)生加樣上的誤差。

2．根據(jù)待測樣品數(shù)量加上標(biāo)準(zhǔn)品的數(shù)量決定所需的板條數(shù)。每個標(biāo)準(zhǔn)品和空白孔建議做復(fù)孔。每個樣品根據(jù)自己的數(shù)量來定，能使用復(fù)孔的盡量做復(fù)孔。

3．加入稀釋好后的標(biāo)準(zhǔn)品50ul于反應(yīng)孔、加入待測樣品50ul于反應(yīng)孔內(nèi)。立即加入50ul的標(biāo)記的抗體。蓋上膜板，輕輕振蕩混勻，37℃溫育小時。

4．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作四次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

5．每孔加入80ul的親和鏈酶素-HRP，輕輕振蕩混勻，37℃溫育30分鐘。

6．甩去孔內(nèi)液體，每孔加滿洗滌液，振蕩30秒，甩去洗滌液，用吸水紙拍干。重復(fù)此操作四次。如果用洗板機(jī)洗滌，洗滌次數(shù)增加一次。

7．每孔加入底物A、B各50ul，輕輕振蕩混勻，37℃溫育5分鐘。避免光照。

8．取出酶標(biāo)板，迅速加入50ul終止液，加入終止液后應(yīng)立即測定結(jié)果。

9．在450nm波長處測定各孔的OD值。

結(jié)果分析

大鼠E-選擇素E-selectin以吸光度OD值為縱坐標(biāo)（Y），相應(yīng)的E-selectin 標(biāo)準(zhǔn)品濃度為橫坐標(biāo)（X），做得相應(yīng)的曲線，樣品的E-selectin 含量可根據(jù)其OD值由標(biāo)準(zhǔn)曲線換算出相應(yīng)的濃度。

局限

6號標(biāo)準(zhǔn)品以上的結(jié)果為非線性的，根據(jù)此標(biāo)準(zhǔn)曲線無法得到的結(jié)果。

試劑盒性能

．靈敏度：zui小的檢測濃度小于號標(biāo)準(zhǔn)品。稀釋度的線性。樣品線性回歸與預(yù)期濃度相關(guān)系數(shù)R值為0.990。

2．特異性：不與人其它細(xì)胞因子反應(yīng)。

3．重復(fù)性：板內(nèi)、板間變異系數(shù)均小于0%。