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牛血清在細胞培養(yǎng)中質(zhì)量檢查方法

更新時間:2015-05-21 點擊量:638

檢查方法:
已證明無外源因子污染的牛細胞培養(yǎng)物,在細胞生長液中加5%待測血清,連傳3代共2天。陰性對照細胞培養(yǎng)液中加5%已知無病毒污染的牛血清,與試驗組同條件下進行。在觀察期內(nèi)注意細胞形態(tài)變化或細胞病變。在觀察期內(nèi)第4天待檢樣品和對照樣品用標準病毒檢測方法檢查。
如待檢細胞培養(yǎng)物經(jīng)消化后分種到6個含蓋玻片的容器內(nèi)。陰性對照樣品按同樣方法。再將牛腹泄病毒、牛細小病毒、牛腺病毒、狂犬病毒和呼腸弧病毒分別加入待檢培養(yǎng)物蓋玻片容器內(nèi)作為陽性對照,再培養(yǎng)7天,用熒光抗體技術(shù)進行檢查。
細胞病變或病毒引起的其他改變通過蘇木精或伊紅染色進行觀察。取另外一個待檢細胞培養(yǎng)瓶用人“O"紅細胞、豚鼠紅細胞和新鮮雞紅細胞作血球吸附病毒檢查。試驗在2~8℃和20~24℃進行。陰性對照細胞預(yù)先感染副流感Ⅲ型病毒作為陽性對照。未感染的細胞作為陰性對照。
3)內(nèi)毒素檢測
用鱟試劑檢查。
4)細菌噬菌體檢查
主要檢查E.Coli(C300 or K-2)噬菌體。
5)激素含量測定
每批FBS對某些激素含量都要進行測定,包括:雌二醇、胰島素、孕硐、睪丸素、甲狀腺素等。
6)血紅蛋白檢測
血紅蛋白與氧合血紅蛋白的比≥70%,血紅蛋白含量≤mg5/dl。
7)細胞生果測定
a.細胞克隆效果測定
細胞選擇:Sp20/Ag-4 或P3X63-Ag8.653
血清濃度與細胞數(shù):
0%血清/個細胞/孔
4%血清/5個細胞/孔
細胞培養(yǎng)基RPMI-640, 96孔培養(yǎng)盤36℃±2℃,5%二氧化碳培養(yǎng)0~5天。試驗中選擇一個已知參考牛血清作對照。
克隆效率計算:
克隆效率=(陽性孔平均數(shù)/ 培養(yǎng)孔總數(shù)) X00% 
相對克隆效率=待測血清克隆效率/參考血清克隆效率
b.貼壁效率試驗:
用人的傳代細胞作每批血清的貼壁效率試驗,A549(人肺癌細胞)該細胞可以反應(yīng)出低濃度血清的貼壁變化。采用6孔培養(yǎng)盤每批血清用兩種濃度和兩種不同的細胞接種數(shù)即0%血清――00細胞/孔,4%血清200介細胞/孔。放36℃±2℃,濕潤5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)0~4天,計算著色細胞克隆,確定貼壁效率。從這兩種不同血清濃度來確立實驗血清支持細胞貼壁生長的水平,分析兩種試驗條件下平均貼壁效率。
貼壁效率(%)=(每孔克隆平均數(shù)/ 每孔活存的培養(yǎng)細胞平均數(shù)) X00%
相對貼壁效率=被測血清貼壁效率/參考血清貼壁效率
c. 二倍體纖維細胞促生長試驗
株    WI28     MRc5
25cm2細胞培養(yǎng)瓶,5%血清,每瓶接種.5X05細胞連傳3代,每代血清濃度和接種細胞數(shù)相同,每代培養(yǎng)7天,每代接種二個細胞瓶,36℃±2℃培養(yǎng)。以同樣條件用已知參考血清進行平行培養(yǎng)。每代收獲細胞計數(shù),計算每批待檢血清與參考血清的相對生長率(RGR)。
RGR=(試驗血清每瓶細胞平均數(shù)/ 參考血清每瓶細胞平均數(shù)) X00%
牛血清主要質(zhì)量要求(Sigma)

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