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傳代培養細胞的方法

更新時間:2015-11-18 點擊量:744

方法

()培養細胞:取處于指數生,用較大平皿培養的,80%~90%匯合單層培養細胞

(2)加秋水仙素:使用zui終濃度為O.02~O.8gg/ml營養液;溫箱繼續培養6~0h;麥用低溫封閉法:把培養細胞置于4℃條件下6~2h后,再于37℃溫箱中繼續培養6~0h處理(加秋水仙素)。

(3)采集分裂細胞:可利用分裂中期細胞體變圓與底物附著不牢特點,此時手持培養瓶,左右反復橫向水平搖動,令培養液在培養細胞表面反復沖洗,應用此法可使90%的中期分裂細胞從瓶壁脫落;注意勿用力過猛,以防多量非分裂細胞脫落影響觀察。

(4)離心:收集培養液,000r/min離心5~lOmin。

(5)低滲處理:吸除上清液、加入預溫至37℃的0.075 mol/L KCl溶液,在溫箱中靜置
20~30min.

(6)預固定:向懸液中加新鮮:3醋酸、甲醇固定液lml,用吸管吹打均勻;此措施能起到先使細胞表面輕微固定,可防止固定后細胞粘連成塊。

(7)固定;離心,同(4),吸除上清液,加新鮮固定劑5~0ml;加固定劑時要用一手微斜持離心管,另手用吸管吸取固定劑,把固定劑逐滴滴在離心管壁上·使之慢慢流人離心管中,然后輕輕吹打均勻,置5~20min。

(8)重復(7),末次離心后,小心吸除大部上清液,據懸液中細胞密度大小,余下固定液0.5~ml。

(9)制片:用滴片法制片,按如下步驟:*洗凈載物片,勿留任何油脂,置冰箱中儲存備用。滴片前先從冰箱中取出冷載物片張,在載物片表面出現細微水氣時,立即向片的一側滴2~3滴細胞懸液(如固定液不散,可能因載物片未洗凈或不冷所致)·滴片時的距離能保持半米高度才好。滴片后置室溫中令其自然干燥,或用吹風機熱風吹干亦可。如此制備好的標本可置盒中備用(做顯帶或熒光觀察等)或立即進行染色觀察。

(0)染色和封片:一般常用Giemsa染色;取干液Giemsa 份加pH6.8磷酸緩沖液9份混合,染色0min后,水洗、晾干、可直接觀察(使用油浸鏡);如標本需要保存或做長時間觀察,可過二甲苯兩次后,用中性樹膠封片(或先迅速過丙酮兩次,每次30s)后,再過二甲苯,然后封片亦可。

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