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雞胚原代細胞制備及培養技術

更新時間:2015-12-23 點擊量:1352

)訓練目的

    了解雞胚的發育過程;掌握雞胚原代細胞制備及培養技術。

2)實驗材料

①試劑:Hank’s液、含0%~20%血清的細胞培養液、碘酊棉、酒精棉、0.25%。

②器材:超凈工作臺或生物安全柜、細胞培養瓶、洗耳球、滅菌吸管、平皿、毛細吸管、離心管、剪刀、小鑷子、CO2培養箱、倒置顯微鏡。

3)操作步驟

()雞胚的孵育

受精雞胚放在蛋托上,大頭朝上,放人溫箱培養。在溫箱底部放上一盤水,溫度調至37.8℃。

(2)雞胚的發育過程

①觀察方法:將9~2 d的雞胚取出,放人平皿中進行觀察。

②雞胚的發育:采用雞胚進行細胞培養時,應對雞胚的發育有一個初步了解。雞胚的發育是由受精卵開始的。它在通過輸卵管時,已開始分裂,當產卵時已在卵黃上部形成一層細孢,稱為胚盤,在適宜的條件下胚盤繼續分裂生長。在發育過程中從卵黃和卵白中獲取養料和水分.由于胚體和卵黃分開的緣故,胚胎只通過卵黃帶與卵黃相連。發育的早期形成3個胚層,即外胚層、中胚層和內胚層,由此形成的胚胎的各個器官和組織。一般孵育至3 d出現尿囊,為直腸側部分的膨出物,尿囊膜是由內胚層和中胚層構成的。至第4~5 d胚體出現羊膜、尿囊膜及絨毛膜層包被。羊膜系由外胚層和中胚層組成,開始時緊貼于胚體上,后來腔內逐漸充滿羊水。尿囊膜在生長發育的過程中,與絨毛膜相連而成絨毛尿囊膜,此膜由三層細胞組成:外層為外胚層,內層為內胚層,中間為中胚層,其中有很多血管,有兩條主動脈自卵黃囊延伸到此膜中,與此并行有兩條主靜脈,匯成一較大的尿囊靜脈。絨毛尿囊膜是雞胚的呼吸器官,位于殼膜之內。此膜生長發育很快,第0 d已包圍了整個雞胚,此時雞胚已出現羽毛,呼吸道的發育在第2~5 d出現。胚胎體積逐漸增大時,胚胎腔外體液El趨減少,孵出小雞時已無胚胎腔外體液。在發育早期,尿囊液及羊水的成分與生理鹽水溶液相差無幾,2 d后羊水的蛋白含量及黏稠度增加,尿囊腔積累了腎臟的排泄物,因此,在2 d或3 d后,尿囊液由于尿酸鹽的存在,使原來透明的液體呈現混濁。尿囊液的酸堿度在7—2 d期間呈弱堿性,在孵育的末期為pH 6.O。6~3 d雞胚羊水的平均量為5—0mL,至3 d有時可達lO mL。卵白的水分在發育的zui初7 d中轉移到卵黃囊內,在第6 d卵白轉入羊水腔為胚胎所吞食。卵黃在發育時逐漸被一層細胞包圍,自2 d以后卵黃逐漸干燥,在孵出之后24~48 h,整個卵黃囊被吸入小雞腹腔內,供雛雞出生后zui初幾天的營養。

(3)雞胚原代的細胞培養

①消毒:選9~2 d的雞胚2—3個放入超凈工作臺中,大頭(氣室)朝上放置,先用碘酊棉,消毒氣室部位。

②取雞胚:用鑷子剝去頭、四肢及內臟,洗2—3次,用Hank's液洗去紅細胞,吸去液體。

③剪碎雞胚及清洗:用小剪刀將雞胚反復剪碎成泥狀,加Hank's液,吸入細胞培養瓶,稍靜置,讓組織下沉,吸去液體。用Hank's液洗2~3次,吸去液體,以去除紅細胞等。

④加:根據組織的多少加入一定量的O.25%,的量以將組織塊浸泡在中為適中,一個雞胚一般加0.25%的4~5 mL。

⑤消化:用膠塞封緊,輕搖均勻,置4℃冰箱靜置過夜或37 ℃水浴消化 h。

⑥洗去:消化完畢后,吸出,用Hank's液或PBS洗3次以洗去,吸去洗液后。洗時注意輕搖,如猛烈搖動,會將組織塊搖散,吸去洗液后,用營養液將細胞洗出,放入培養瓶。

⑦計數培養:加入適量的*培養液(0~20 mL),用吸管反復吹打形成細胞懸液,用細胞計數法,計算每mL營養液中的細胞數,根據所計算的細胞數,將原液稀釋成06個/mL。將稀釋好的細胞懸液接種到培養瓶中,一般200 mL培養瓶,放5—20 mL培養液,節約時可放lO mL培養液,培養液的量以覆蓋瓶底為適中。

⑧放入37℃、5%CO2溫箱培養:培養時,培養瓶的蓋不要擰得太緊,以不會下掉為度,以便CO2進入。培養~2 d后長成單層細胞,即可應用。

4)注意事項

①全部操作過程應在無菌條件下完成。

②故人5%CO2溫箱培養的目的是5%CO2能調節培養瓶中的pH,使之在一個星期或更長時間pH保持不變。

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