、免疫動(dòng)物

免疫動(dòng)物是用目的抗原免疫小鼠，使小鼠產(chǎn)生致敏B淋巴細(xì)胞的 過程。 一般選用6-8周齡雌性BALB/c小鼠，按照預(yù)先制定的免疫方案進(jìn)行免疫注射。 抗原通過血液循環(huán)或淋巴循環(huán)進(jìn)入外周免疫器官，刺激相應(yīng)B淋巴細(xì)胞克隆，使其活化、增殖，并分化成為致敏B淋巴細(xì)胞。

2、細(xì)胞融合

采用二氧化碳?xì)怏w處死小鼠，無菌操作取出脾臟，在平皿內(nèi)擠壓研磨，制備脾細(xì)胞懸液。 將準(zhǔn)備好的同系骨髓瘤細(xì)胞與小鼠脾細(xì)胞按一定比例混合，并加入促融合劑聚乙二醇。在聚乙二醇作用下，各種淋巴細(xì)胞可與骨髓瘤細(xì)胞發(fā)生融合，形成雜交瘤細(xì)胞。

3、選擇性培養(yǎng)

選擇性培養(yǎng)的目的是篩選融合的雜交瘤細(xì)胞，一般采用HAT選擇性培養(yǎng)基。在HAT培養(yǎng)基中，未融合的骨髓瘤細(xì)胞因缺乏次黃嘌呤--磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，不能利用補(bǔ)救途徑合成DNA而死亡。 未融合的淋巴細(xì)胞雖具有次黃嘌呤--磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，但其本身不能在體外存活也逐漸死亡。 只有融合的雜交瘤細(xì)胞由于從脾細(xì)胞獲得了次黃嘌呤--磷酸核糖轉(zhuǎn)移酶，并具有骨髓瘤細(xì)胞能無限增殖的特性，因此能在HAT培養(yǎng)基中存活和增殖。

4、雜交瘤陽性克隆的篩選與克隆化

在HAT培養(yǎng)基中生長的雜交瘤細(xì)胞，只有少數(shù)是分泌預(yù)定特異性單克隆抗體的細(xì)胞，因此，必須進(jìn)行篩選和克隆化。通常采用有限稀釋法進(jìn)行雜交瘤細(xì)胞的克隆化培養(yǎng)。采用靈敏、快速、特異的免疫學(xué)方法，篩選出能產(chǎn)生所需單克隆抗體的陽性雜交瘤細(xì)胞，并進(jìn)行克隆擴(kuò)增。經(jīng)過全面鑒定其所分泌單克隆抗體的免疫球蛋白類型、亞類、特異性、親和力、識(shí)別抗原的表位及其分子量后，及時(shí)進(jìn)行凍存。

5、單克隆抗體的大量制備

單克隆抗體的大量制備主要采用動(dòng)物體內(nèi)誘生法和體外培養(yǎng)法。
()體內(nèi)誘生法 取BALB/c小鼠，首先腹腔注射0.5ml液體石蠟或降植烷進(jìn)行預(yù)處理。-2周后，腹腔內(nèi)接種雜交瘤細(xì)胞。雜交瘤細(xì)胞在小鼠腹腔內(nèi)增殖，并產(chǎn)生和分泌單克隆抗體。約-2周，可見小鼠腹部膨大。用注射器抽取腹水，即可獲得大量單克隆抗體。
(2)體外培養(yǎng)法 將雜交瘤細(xì)胞置于培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。在培養(yǎng)過程中，雜交瘤細(xì)胞產(chǎn)生并分泌單克隆抗體，收集培養(yǎng)上清液，離心去除細(xì)胞及其碎片，即可獲得所需要的單克隆抗體。但這種方法產(chǎn)生的抗體量有限。各種新型培養(yǎng)技術(shù)和裝置不斷出現(xiàn)，大大提高了抗體的量。

抗原準(zhǔn)備

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抗原，是指能夠刺激機(jī)體產(chǎn)生（特異性）免疫應(yīng)答，并能與免疫應(yīng)答產(chǎn)物抗體和致敏淋巴細(xì)胞在體外結(jié)合，發(fā)生免疫效應(yīng)（特異性反應(yīng)）的物質(zhì)。抗原的基本特性有兩種，一是誘導(dǎo)免疫應(yīng)答的能力，也就是免疫原性，二是與免疫應(yīng)答的產(chǎn)物發(fā)生反應(yīng)，也就是抗原性。
很多物質(zhì)都可以成為抗原，抗原的具體分類可以參見抗原，在進(jìn)行單克隆抗體制備過程中，很多物質(zhì)都可以成為抗原，在常規(guī)的科研實(shí)驗(yàn)中，科研者經(jīng)常選用每只小鼠/大鼠每次注射0~50ug重組蛋白、偶聯(lián)多肽、偶聯(lián)小分子等作為抗原產(chǎn)生特異性的單克隆抗體。

動(dòng)物免疫

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單克隆抗體制備的宿主動(dòng)物一般選用BALB/c小鼠，鼠單抗的應(yīng)用范圍相當(dāng)廣泛，一些國內(nèi)外公司均開發(fā)出了兔的單克隆抗體制備技術(shù)。
免疫原分為可溶性抗原和顆粒性（細(xì)胞）抗原，用無菌鹽水稀釋并與佐劑混合，腹腔注射抗原與佐劑*混勻后形成的穩(wěn)定乳狀液，在免疫原提供持續(xù)的免疫應(yīng)答基礎(chǔ)上進(jìn)行加強(qiáng)免疫
周期第天 采血0.2ml（獲得0.ml免疫前血清）
*次免疫（抗原加弗氏*佐劑）
第4天 第二次免疫（抗原加弗氏不*佐劑）
第2天 采血和ELISA檢測
第35天 第三次免疫（抗原加弗氏不*佐劑）
第42天 采血和ELISA檢測
第56天 第四次免疫（抗原溶于PBS或鹽水）
第6天 細(xì)胞融合

細(xì)胞融合

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（一）融合劑

細(xì)胞融合的方法有物理法，如電融合、激光融合，化學(xué)融合法和生物融合法，如滅活的仙臺(tái)病毒，此處例舉化學(xué)融合法中的一種即聚乙二醇融合法。聚乙二醇（PEG），在分子量為200～700時(shí)，呈無色、無臭的粘稠狀液體，分子量大于000時(shí)，呈乳白色蠟狀固體，能溶于水、乙醇及其他許多有機(jī)溶劑，對熱穩(wěn)定，與許多化學(xué)藥品不起作用。用作細(xì)胞融合劑的聚乙二醇一般選用分子量為4000者，常用濃度為50%，pH8.0～pH8.2（用0%NaHCO3調(diào)整），分子量小的PEG，融合效應(yīng)差，又有毒性，分子量過大，則粘性太大，不易操作。50%濃度，pH偏堿時(shí)融合效應(yīng)zui高。也有采用30%～50%濃度的PEG加上0%二甲亞砜。不同批號(hào)的PEG，即使分子量相同，但融合率卻有明顯差異，選用時(shí)必須注意。每批都必須進(jìn)行細(xì)胞毒性試驗(yàn)后方可應(yīng)用。要買高純度的，一般選供氣相色譜用的PEG。