豬急性腎損傷(NGAL)ELISA試劑盒操作指南

本試劑僅供研究使用       目的：本試劑盒用于測定豬血清，血漿及相關(guān)液體樣本中急性腎損傷(NGAL)的含量。

實驗原理：

   本試劑盒應(yīng)用雙抗體夾心法測定標本中豬急性腎損傷(NGAL)水平。用純化的豬急性腎損傷(NGAL)抗體包被微孔板，制成固相抗體，往包被單抗的微孔中依次加入急性腎損傷(NGAL)，再與HRP標記的急性腎損傷(NGAL)抗體結(jié)合，形成抗體-抗原-酶標抗體復(fù)合物，經(jīng)過*洗滌后加底物TMB顯色。TMB在HRP酶的催化下轉(zhuǎn)化成藍色，并在酸的作用下轉(zhuǎn)化成zui終的黃色。顏色的深淺和樣品中的急性腎損傷(NGAL)呈正相關(guān)。用酶標儀在450nm波長下測定吸光度（OD值），通過標準曲線計算樣品中豬急性腎損傷(NGAL)濃度。

豬急性腎損傷(NGAL)ELISA試劑盒組成：

試劑盒組成

48孔配置

96孔配置

保存

操作指南

份

份

封板膜

2片（48）

2片（96）

密封袋

個

個

酶標包被板

×48

×96

2-8℃保存

標準品：35ng/ml

0.5ml×瓶

0.5ml×瓶

2-8℃保存

標準品稀釋液

.5ml×瓶

.5ml×瓶

2-8℃保存

酶標試劑

3 ml×瓶

6 ml×瓶

2-8℃保存

樣品稀釋液

3 ml×瓶

6 ml×瓶

2-8℃保存

顯色劑A液

3 ml×瓶

6 ml×瓶

2-8℃保存

顯色劑B液

3 ml×瓶

6 ml×瓶

2-8℃保存

終止液

3ml×瓶

6ml×瓶

2-8℃保存

濃縮洗滌液

（20ml×20倍）×瓶

（20ml×30倍）×瓶

2-8℃保存

豬急性腎損傷(NGAL)ELISA試劑盒樣本處理及要求：

. 血清：室溫血液自然凝固0-20分鐘，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如出現(xiàn)沉淀，應(yīng)再次離心。

2. 細胞培養(yǎng)上清：檢測分泌性的成份時，用無菌管收集。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。檢測細胞內(nèi)的成份時，用PBS（PH7.2-7.4）稀釋細胞懸液，細胞濃度達到00萬/ml左右。通過反復(fù)凍融，以使細胞破壞并放出細胞內(nèi)成份。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。

3. 組織標本：切割標本后，稱取重量。加入一定量的PBS，PH7.4。用液氮迅速冷凍保存?zhèn)溆谩吮救诨笕匀槐３?-8℃的溫度。加入一定量的PBS（PH7.4），用手工或勻漿器將標本勻漿充分。離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清。分裝后一份待檢測，其余冷凍備用。

4. 標本采集后盡早進行提取，提取按相關(guān)文獻進行，提取后應(yīng)盡快進行實驗。若不能馬上進行試驗，可將標本放于-20℃保存，但應(yīng)避免反復(fù)凍融.

5. 血漿：應(yīng)根據(jù)標本的要求選擇EDTA或檸檬酸鈉作為抗凝劑，混合0-20分鐘后，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)該再次離心。

6. 尿液：用無菌管收集，離心20分鐘左右（2000-3000轉(zhuǎn)/分）。仔細收集上清，保存過程中如有沉淀形成，應(yīng)再次離心。胸腹水、腦脊液參照實行。

7. 不能檢測含NaN3的樣品，因NaN3抑制辣根過氧化物酶的（HRP）活性。

豬急性腎損傷(NGAL)ELISA試劑盒操作步驟

標準品的稀釋與加樣：在酶標包被板上設(shè)標準品孔0孔，在*、第二孔中分別加標準品00μl，然后在*、第二孔中加標準品稀釋液50μl，混勻；然后從*孔、第二孔中各取00μl分別加到第三孔和第四孔，再在第三、第四孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻；然后在第三孔和第四孔中先各取50μl棄掉，再各取50μl分別加到第五、第六孔中，再在第五、第六孔中分別加標準品稀釋液50ul，混勻；混勻后從第五、第六孔中各取50μl分別加到第七、第八孔中，再在第七、第八孔中分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第七、第八孔中分別取50μl加到第九、第十孔中，再在第九第十孔分別加標準品稀釋液50μl，混勻后從第九第十孔中各取50μl棄掉。（稀釋后各孔加樣量都為50μl，濃度分別為90 ng/ml，60 ng/ml ，30 ng/ml，5 ng/ml， 7.5 ng/ml）。
加樣：分別設(shè)空白孔（空白對照孔不加樣品及酶標試劑，其余各步操作相同）、待測樣品孔。在酶標包被板上待測樣品孔中先加樣品稀釋液40μl，然后再加待測樣品0μl（樣品zui終稀釋度為5倍）。加樣將樣品加于酶標板孔底部，盡量不觸及孔壁，輕輕晃動混勻。
溫育：用封板膜封板后置37℃溫育30分鐘。
配液：將30（48T的20倍）倍濃縮洗滌液用蒸餾水30（48T的20倍）倍稀釋后備用。
洗滌：小心揭掉封板膜，棄去液體，甩干，每孔加滿洗滌液，靜置30秒后棄去，如此重復(fù)5次，拍干。
加酶：每孔加入酶標試劑50μl，空白孔除外。
溫育：操作同3。
洗滌：操作同5。
顯色：每孔先加入顯色劑A50μl，再加入顯色劑B50μl，輕輕震蕩混勻，37℃避光顯色5分鐘.
終止：每孔加終止液50μl，終止反應(yīng)（此時藍色立轉(zhuǎn)黃色）。
測定：以空白空調(diào)零，450nm波長依序測量各孔的吸光度（OD值）。 測定應(yīng)在加終止液后5分鐘以內(nèi)進行。

注意事項：

試劑盒從冷藏環(huán)境中取出應(yīng)在室溫平衡5-30分鐘后方可使用，酶標包被板開封后如未用完，板條應(yīng)裝入密封袋中保存。
濃洗滌液可能會有結(jié)晶析出，稀釋時可在水浴中加溫助溶，洗滌時不影響結(jié)果。
各步加樣均應(yīng)使用加樣器，并經(jīng)常校對其準確性，以避免試驗誤差。一次加樣時間控制在5分鐘內(nèi)，如標本數(shù)量多，使用排槍加樣。
請每次測定的同時做標準曲線，做復(fù)孔。如標本中待測物質(zhì)含量過高（樣本OD值大于標準品孔*孔的OD值），請先用樣品稀釋液稀釋一定倍數(shù)（n倍）后再測定，計算時請zui后乘以總稀釋倍數(shù)（×n×5）。
封板膜只限一次性使用，以避免交叉污染。
底物請避光保存。
嚴格按照說明書的操作進行，試驗結(jié)果判定必須以酶標儀讀數(shù)為準.
所有樣品，洗滌液和各種廢棄物都應(yīng)按傳染物處理。
本試劑不同批號組分不得混用。

8. 如與英文說明書有異，以英文說明書為準。

[文本框:] 計算：

以標準物的濃度為橫坐標，OD值為縱坐標，   

在坐標紙上繪出標準曲線，根據(jù)樣品的OD     

值由標準曲線查出相應(yīng)的濃度；再乘以稀釋     

倍數(shù)；或用標準物的濃度與OD值計算出標     

準曲線的直線回歸方程式，將樣品的OD值     

代入方程式，計算出樣品濃度，再乘以稀釋     

倍數(shù)，即為樣品的實際濃度。