進(jìn)口細(xì)胞株蛋白（Cytoglobin,Cygb）是一種細(xì)胞內(nèi)抗氧化蛋白，是近發(fā)現(xiàn)的脊椎動(dòng)物珠蛋白超家族中的一員，它具有保護(hù)細(xì)胞、抑制腫瘤細(xì)胞增長的功能。進(jìn)行酵母雙雜交文庫構(gòu)建，篩選出與CYGB相互作用的蛋白，為進(jìn)一步研究CYGB的功能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。酵母雙雜交文庫構(gòu)建是篩庫的前提，可用于目的蛋白的互作蛋白大規(guī)模篩選分析蛋白質(zhì)間的相互作用，是現(xiàn)在分子生物學(xué)與生物化學(xué)常用的手段。
酵母雙雜交技術(shù)是一種具有很高靈敏度的研究蛋白質(zhì)之間關(guān)系的技術(shù)，大的優(yōu)點(diǎn)就是不需要分離純化蛋白質(zhì)，整個(gè)過程只是對核酸進(jìn)行操作，同時(shí)充分利用酵母生長速度快、易于操作等特點(diǎn)，酵母雙雜交文庫構(gòu)建一般包括核體系和膜體系兩種方法。美迪西提供酵母雙雜交服務(wù)，具有獨(dú)立實(shí)驗(yàn)室，專業(yè)實(shí)驗(yàn)人員，提供詳細(xì)的酵母雙雜交實(shí)驗(yàn)步驟、原始數(shù)據(jù)和圖片、結(jié)果分析，可以出具檢測數(shù)據(jù)報(bào)告。
進(jìn)口細(xì)胞株蛋白初由日本Tawada等在200年在大鼠纖維化肝臟的星狀細(xì)胞中發(fā)現(xiàn)了此種蛋白。由于其具有緊湊的螺旋形結(jié)構(gòu)和結(jié)合血紅素的能力，可可逆的結(jié)合各類氣體分子，如氧氣、一氧化氮等。Cygb在缺氧時(shí)表達(dá)上調(diào)且特定地表達(dá)在毛細(xì)血管周圍，提示其可能具有氧感受器的作用。Cybd可以作為清道夫，清除組織缺血后再灌注時(shí)產(chǎn)生的ROS和NO分子。此外它還具有過氧化氫酶活性，在肝星狀細(xì)胞中其過氧化物清除劑的作用。研究顯示，Cygb對肝纖維化的逆轉(zhuǎn)有著非常顯著的作用。
Cygb具有預(yù)防肝纖維化、實(shí)現(xiàn)肝纖維化逆轉(zhuǎn)的功能，且其作用是通過調(diào)控HSC的激活狀態(tài)實(shí)現(xiàn)的，與肝臟中細(xì)胞及細(xì)胞外基質(zhì)間的氧化應(yīng)激密切相關(guān)。有研究者選取了兩種肝臟中有代表性的氧化模型，過氧化氫模型及鐵過載模型，系統(tǒng)性研究了Cygb在肝纖維化氧化應(yīng)激中發(fā)揮的具體作用，并結(jié)合microRNA(miRNA)技術(shù)，初步探索了Cygb在肝星狀細(xì)胞激活時(shí)表達(dá)上調(diào)的可能性機(jī)制。該研究為全面闡釋Cygb這一治療基因的抗氧化作用及機(jī)制、加速藥物新靶點(diǎn)開發(fā)提供了理論依據(jù)。
有研究者通過酵母雙雜交篩選出7個(gè)與Cygb相互作用的蛋白，環(huán)指蛋白2(RNF2)是其中之一，為進(jìn)一步研究Cygb的功能機(jī)制奠定基礎(chǔ)。首先進(jìn)行酵母雙雜交文庫構(gòu)建，篩選Mate&PlateTMLibrary-UniversalHuman(Normalized)人源標(biāo)準(zhǔn)化cDNA文庫，尋找與Cygb相互作用的蛋白，然后研究者通過酵母回復(fù)性雜交實(shí)驗(yàn)和免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步驗(yàn)證Cygb與RNF2之間的相互作用。
環(huán)指蛋白2(RNF2)屬于多梳家族，是多梳抑制復(fù)合物(PRC)中的一員。RNF2可以介導(dǎo)組蛋白H2A的泛素化，因此RNF2在多梳結(jié)構(gòu)介導(dǎo)的基因抑制中發(fā)揮重要作用。RNF2作為PRC家族的一員，在胃癌、結(jié)腸癌、淋巴癌等多種癌癥中高表達(dá)。RNF2具有原癌基因的活性，敲除RNF2的HeLa細(xì)胞形態(tài)會(huì)發(fā)生改變，,細(xì)胞增殖也會(huì)受到抑制。RNF2是一種E3連接酶，與P53具有直接的相互作用，在人結(jié)腸癌HCT6細(xì)胞系中它可以以p53為靶點(diǎn)通過蛋白酶體途徑，促進(jìn)p53的降解，從而影響P53下游基因的表達(dá)水平，以調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡。
據(jù)此研究者推測Cygb與RNF2之間的相互作用很可能與腫瘤的發(fā)生發(fā)展具有一定的關(guān)聯(lián)性。該研究具有以下作用:
（）成功構(gòu)建了pGBKT7-Cygb重組表達(dá)載體，該重組質(zhì)粒在Y2HGold酵母菌株成功表達(dá)BD-Cygb-MYC融合蛋白，且Cygb誘餌蛋白對Y2HGold酵母細(xì)胞無毒性作用、無自激活活性。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，pGBKT7-Cygb酵母誘餌表達(dá)載體構(gòu)建成功，可以用于文庫篩選。
（2）以pGBKT7-Cygb重組質(zhì)粒為誘餌從Mate&PlateTMLibrary-UniversalHuman(Normalized)文庫中篩選CYGB的相互作用蛋白，終得到32個(gè)藍(lán)色的陽性克隆。陽性克隆質(zhì)粒的PCR產(chǎn)物經(jīng)測序鑒定、比對初步得到了7個(gè)細(xì)胞珠蛋白的相互作用基因。其中RNF2、SLC7A3、ATPB這三個(gè)基因重復(fù)出現(xiàn)多次。RNF2基因一共重復(fù)出現(xiàn)次，并且與癌癥相關(guān)，是研究者們驗(yàn)證和深入研究的重點(diǎn)。
（3）經(jīng)酵母回復(fù)性雜交實(shí)驗(yàn)證明在酵母中RNF2確實(shí)能與Cygb發(fā)生相互作用。經(jīng)免疫共沉淀實(shí)驗(yàn)證明RNF2和Cygb在HEK293T細(xì)胞中發(fā)生了相互作用。
（4）在人結(jié)腸癌HCT6細(xì)胞中，Cygb過表達(dá)可以提高RNF2的mRNA水平，降低P53和P2的mRNA水平。提示Cygb很可能正向調(diào)控RNF2，從而影響腫瘤的發(fā)生發(fā)展。
通過酵母雙雜交系統(tǒng)篩選出與進(jìn)口細(xì)胞株蛋白相互作用蛋白的研究，為進(jìn)一步加深對進(jìn)口細(xì)胞株蛋白生物學(xué)功能的認(rèn)識，和為治療肝纖維化等疾病提供堅(jiān)實(shí)的理論基礎(chǔ)。