人小腦顆粒分離自小腦皮層組織；神經(jīng)元是神經(jīng)系統(tǒng)最基本的結(jié)構(gòu)與功能單位，小腦顆粒神經(jīng)元是體積較小的神經(jīng)元，直徑約10μm，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中含量非常豐富，近乎神經(jīng)元數(shù)量的一半。由于小腦神經(jīng)元的生長、分化和大腦皮層神經(jīng)元相似，而且數(shù)量多、便于取材，因此小腦顆粒神經(jīng)元是研究神經(jīng)元生長發(fā)育、神經(jīng)軸突再生及神經(jīng)疾病發(fā)生機(jī)制和臨床神經(jīng)藥理的重要手段。小腦顆粒神經(jīng)元是小腦主要的中間神經(jīng)元，在哺乳動物的小腦內(nèi)數(shù)量最為豐富。顆粒神經(jīng)元的軸突與苔狀纖維和爬行纖維相聯(lián)系，形成小腦皮層內(nèi)的神經(jīng)元環(huán)路，在小腦的神經(jīng)活動中起著非常重要的作用。在動物傳染性海綿狀腦病中，病變可波及小腦顆粒神經(jīng)元，導(dǎo)致小腦皮層的神經(jīng)元環(huán)路受損，從而呈現(xiàn)神經(jīng)性行為失調(diào)。研究小腦顆粒神經(jīng)元在動物傳染性海綿狀腦病病理學(xué)變化中的反應(yīng)、病理發(fā)生的機(jī)理特別是分子機(jī)理，有賴于小腦顆粒神經(jīng)元細(xì)胞模型的建立。小腦顆粒細(xì)胞的軸突是沿冠狀軸分布的平行纖維，正是這種排列保證了興奮的單向傳導(dǎo)，這是小腦功能理論中的關(guān)鍵假設(shè)，小腦顆粒細(xì)胞通過g-氨基丁酸接受戈?duì)柤?xì)胞的抑制性突觸的信息傳入。
方法簡介：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的人小腦顆粒采用yi蛋白酶消化法結(jié)合神經(jīng)元專用培養(yǎng)基、化學(xué)試劑抑制法篩選制備而來，細(xì)胞總量約為5×10?cells/瓶。
質(zhì)量檢測：

公司實(shí)驗(yàn)室分離的人小腦顆粒經(jīng)β-Tubulin免疫熒光鑒定，純度可達(dá)90%以上，且不含有HIV-1、HBV、HCV、支原體、細(xì)菌、酵母和真菌等。

本公司所有產(chǎn)品僅供科學(xué)實(shí)驗(yàn)，不做其他科學(xué)實(shí)驗(yàn)外的使用！

包被條件 PLL（0.1mg/ml）

培養(yǎng)基 含B-27、Penicillin、Streptomycin等

換液頻率 每2-3天換液一次

生長特性 貼壁

細(xì)胞形態(tài) 神經(jīng)元細(xì)胞樣

傳代特性 屬于終末分化細(xì)胞；屬于不增殖細(xì)胞群

消化液 0.25%yi蛋白酶

培養(yǎng)條件 氣相：空氣，95%；CO2，5%

準(zhǔn)備工作

1. 實(shí)驗(yàn)器材準(zhǔn)備：準(zhǔn)備無菌的培養(yǎng)皿、培養(yǎng)瓶、移液管、離心管、手術(shù)器械等，并進(jìn)行高壓滅菌或其他合適的消毒處理。

2. 試劑準(zhǔn)備：配制或購買合適的培養(yǎng)基、消化酶（如、膠原酶等）、胎牛血清、雙抗等試劑，確保其無菌且在有效期內(nèi)。

3. 實(shí)驗(yàn)動物或組織來源準(zhǔn)備：根據(jù)實(shí)驗(yàn)需求，選擇合適的動物并進(jìn)行相應(yīng)的麻醉或處死，獲取所需組織；或從已有的組織樣本庫中獲取組織。

取材與處理

1. 取材：在無菌條件下，迅速取出目標(biāo)組織，盡量減少對組織的損傷，并去除多余的脂肪、結(jié)締組織等非目的組織。

2. 清洗：將取出的組織用預(yù)冷的無菌PBS沖洗數(shù)次，以去除血液和雜質(zhì)。

3. 剪切：將組織剪成約1 - 2mm3的小塊，以便后續(xù)消化。

細(xì)胞分離

1. 消化：將剪碎的組織塊放入含有適量消化酶的離心管中，在37℃恒溫?fù)u床或培養(yǎng)箱中消化一段時(shí)間。期間可輕輕搖晃離心管，使消化更均勻。

2. 終止消化：當(dāng)組織塊大部分被消化成單細(xì)胞懸液或小細(xì)胞團(tuán)時(shí)，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化。

3. 過濾與離心：用細(xì)胞篩過濾細(xì)胞懸液，去除未消化的組織碎片，然后將濾液以適當(dāng)?shù)霓D(zhuǎn)速離心，收集細(xì)胞沉淀。

細(xì)胞觀察與檢測

1. 日常觀察：每天用倒置顯微鏡觀察細(xì)胞的形態(tài)、生長狀態(tài)、密度等，記錄細(xì)胞的變化情況，如發(fā)現(xiàn)細(xì)胞污染或異常，及時(shí)采取相應(yīng)措施。
2. 細(xì)胞計(jì)數(shù)與活力檢測：在需要時(shí)，可采用臺盼藍(lán)染色等方法對細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)和活力檢測，以了解細(xì)胞的生長情況和健康狀態(tài)。

一、取材與分離

1. 快速操作

- 組織取材后需立即處理，避免長時(shí)間暴露于室溫或非營養(yǎng)環(huán)境。

- 使用無菌 PBS 或生理鹽水沖洗組織，去除血液、雜質(zhì)。

2. 消化酶選擇

- 根據(jù)組織類型選擇消化酶，避免過度消化導(dǎo)致細(xì)胞損傷。

- 消化時(shí)間需嚴(yán)格控制（通常 10-30 分鐘），可通過顯微鏡觀察細(xì)胞解離狀態(tài)。

二、培養(yǎng)條件優(yōu)化

1. 培養(yǎng)基選擇

- 使用含血清或特定生長因子的培養(yǎng)基（如 DMEM、RPMI 1640 等），部分細(xì)胞需添加胰島素、EGF 等。

- 避免頻繁更換培養(yǎng)基品牌或批次，減少細(xì)胞適應(yīng)壓力。

2. 貼壁與傳代

- 原代細(xì)胞貼壁能力較弱，可能需要包被培養(yǎng)皿（如膠原蛋白、多聚賴氨酸）。

- 傳代時(shí)密度建議控制在 70%-80%，過度匯合會導(dǎo)致接觸抑制和分化。

三、污染控制

1. 無菌操作

- 全程在超凈臺操作，使用一次性耗材，避免交叉污染。

- 培養(yǎng)基中可添加雙抗，但長期使用可能影響細(xì)胞活性。

2. 支原體檢測

- 定期檢測支原體污染（如 PCR 法），污染后需及時(shí)丟棄細(xì)胞。

四、狀態(tài)監(jiān)控

1. 日常觀察

- 每天檢查細(xì)胞形態(tài)、密度及培養(yǎng)基顏色，及時(shí)更換培養(yǎng)基（通常每 2-3 天換液一次）。

- 異常形態(tài)（如細(xì)胞變圓、碎片增多）可能提示污染或營養(yǎng)不足。

2. 傳代與凍存

- 原代細(xì)胞分裂次數(shù)有限（一般 5-10 代），需及時(shí)凍存早期代次細(xì)胞。

- 凍存液建議使用 DMSO+血清（或?qū)Ｓ脙龃媾囵B(yǎng)基），梯度降溫后液氮保存。